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Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Patent DET2 - Verfahren zur reinigung eines neurotrophen faktors aus pigmentiertem - Google Patenten Patent DET3 - Vermittler von "hedgehog" übermittelnden bahnen, dazugehörige - Google Patenten Vessel Due F mit trophischen Geschwüren


Vessel Due F mit trophischen Geschwüren

Inloggen Verborgen velden Patenten www. Verfahren zur Reinigung von PEDNF, der die folgenden Eigenschaften umfasst: 1 er ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von Verfahren nach einem Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Ansprüche 1 bis 3, wobei die unreine Proteinfraktion, die PEDNF enthält, durch pigmentiertes Netzhautepithel konditionierte Medien umfasst.

Method according to one of claims 1 to 3, wherein the impure protein fraction containing PEDNF comprises encompassed by pigmented Netzhautepithel conditioned media.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unreine Proteinfraktion, die PEDNF enthält, einen Extrakt eines nicht-menschlichen Organismus umfasst, der mit einem ein PEDNF-Gen umfassenden rekombinanten DNA-Molekül in einer solchen Form transformiert ist, dass das PEDNF-Gen exprimiert werden kann.

Method according to one of claims 1 to 3, wherein the ihtiolovaya Salbe aus Krampfadern Bewertungen protein fraction containing PEDNF, an extract of a non-human organism comprising transformed with a comprehensive a Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gene recombinant DNA molecule in a form such that the PEDNF- gene can be expressed.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unreine Proteinfraktion, die PEDNF enthält, ein Medium umfasst, in dem ein nicht-menschlicher Organismus gezüchtet wird, der mit einem ein PEDNF-Gen umfassenden rekombinanten DNA-Molekül in einer solchen Form transformiert ist, dass das PEDNF-Gen exprimiert werden kann.

Method according to one of claims 1 to 3, wherein the impure protein fraction containing PEDNF, a medium comprising, in a non-human organism is cultured which is transformed with click at this page comprehensive a Click to see more gene recombinant DNA molecule in such a shape that the PEDNF gene may be expressed.

This invention relates to the purification of a neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel PEDNF. Hintergrund der Erfindung Background of the Invention [] [] Viele Arten von Neuronen sind für more info Überleben und ihr Wohlergehen von der Verfügbarkeit spezieller regulatorischer Moleküle, bekannt als neurotrophe Faktoren, abhängig.

Many types of neurons for their survival and well-being of the availability of specific regulatory molecules, known as neurotrophic factors dependent. Der am besten charakterisierte neurotrophe Faktor ist der Nerven-Wachstumsfaktor NGF.

The best characterized neurotrophic factor is nerve growth factor NGF. NGF reguliert das Überleben und die spezialisierte Funktion der sympathischen und der Dorsalwurzelganglion-Neuronen im peripheren Nervensystem und von einigen cholinergen Neuronen im Zentralnervensystem.

NGF regulates the survival and specialized function of sympathetic and dorsal root ganglion neurons in the peripheral nervous system, and by some cholinergic neurons in the central nervous system. Trophische Faktoren, die auf andere Neuronen wirken, wurden ebenfalls identifiziert und zwei solcher Faktoren, der ciliäre neurotrophe Faktor CNTF und der neurotrophe Faktor aus dem Hirn BDNF wurden gereinigt.

Trophic factors, which act on other neurons, have also been identified, and two such factors, the ciliary neurotrophic factor CNTFand said neurotrophic factor is from the brain BDNF have been purified. Furthermore, it was recently shown that some growth factors such as fibroblast growth factor FGF and epidermal growth factor EGFwhich were originally identified in cells due to its mitogenic effect, also known as http://varizen247.de/behandlung-von-krampfadern-des-magens.php promoting agents for neuronal function.

Postsynaptische Zielzellen und Satellitenzellen wie Gliazellen scheinen die Hauptquellen der neurotrophen Faktoren zu sein. Postsynaptic target Vessel Due F mit trophischen Geschwüren and satellite cells such as glial cells appear to be the main sources of neurotrophic factors. Laser-Behandlung Krampfadern Preise wurde vorgeschlagen, dass das Überleben der Photorezeptorzellen der Netzhaut ebenfalls durch spezifische neurotrophe Faktoren reguliert sein könnte.

It has been proposed that the survival of photoreceptor cells of the retina may also be regulated by specific neurotrophic factors. Ein Hinweis unter anderen, die diese Annahme unterstützen, ist die Beobachtung, dass Photorezeptoren in einigen Arten im Entwicklungsverlauf einen neuronalen Zelltod unterlaufen, ein Phänomen, von dem allgemein angenommen wird, dass es die beschränkte Verfügbarkeit von neurotrophen Faktoren widerspiegelt. A note among others, support this assumption is the observation that photoreceptors in some species undergo a neuronal cell death during development, a phenomenon that is widely accepted by the that it reflects the limited availability of neurotrophic factors.

Es wurde auch gezeigt, Vessel Due F mit trophischen Geschwüren für die Entwicklung von Photorezeptoren, sowie auch für die Erhaltung ihrer normalen Funktion, eine Wechselwirkungen mit dem Pigmentepithel der Netzhaut RPE stattfinden müssen, was darauf hinweist, dass Moleküle oder Faktoren aus dem RPE für die Funktion und das Überleben der Photorezeptoren notwendig sein könnte.

It has also been shown that the development of photoreceptors, as well as for the maintenance of their normal function, interactions with the retinal pigment epithelium RPE must take place, indicating that molecules or factors of the RPE for the function and the survival of photoreceptors might be necessary.

The RPE Vessel Due F mit trophischen Geschwüren over time in front of the neural retina and adjacent to it. In einem geschlossenen Raum zwischen diesen beiden Zellschichten liegt die Interphotorezeptor-Matrix und viele lösliche Produkte des RPE und der Zellen der neuralen Netzhaut sind in dieser Interphotorezeptor-Matrix enthalten. In a closed space between these two cell layers is the interphotoreceptor matrix, and many soluble products of RPE and neural retina cells are contained in the interphotoreceptor matrix.

Nährstoffe, Metabolite und trophische Faktoren die zwischen dem RPE und der neuralen Netzhaut ausgetauscht werden, müssen die Vessel Due F mit trophischen Geschwüren passieren. Nutrients, metabolites and trophic factors that are exchanged Vessel Due F mit trophischen Geschwüren the RPE and neural retina must, the interphotoreceptor matrix happen. Es wird zum Beispiel angenommen, dass die Zellen des Vessel Due F mit trophischen Geschwüren einen Photorezeptor-Überlebensfaktor PSPA synthetisieren und sekretieren.

It is assumed for example, that the cells of the RPE a photoreceptor survival factor PSPA synthesize and secrete. Es ist durchaus denkbar, dass diese oder andere unbekannte Faktoren aus dem RPE die Entwicklung der neuralen Netzhaut beeinflussen können. It is quite possible that these or other unknown factors from Vessel Due F mit trophischen Geschwüren RPE may influence the development Medikamente für Krampfadern the neural retina.

The RPE is neural lineage and forms a monolayer, which is located between the neural retina and the blood circulation within the choroid. Salbe für trophischen Geschwüren der dieser strategischen Lage bildet das RPE einen Teil der Blut-Netzhaut-Schranke, übernimmt für die Integrität und Funktionen der Netzhaut essentielle Aufgaben und spielt eine wichtige Rolle bei vaskulären, entzündlichen, degenerativen und dystrophen Erkrankungen der Netzhaut und der Aderhaut.

In this strategic location, the RPE forms part of the blood-retinal barrier, is not responsible for the integrity and function of the retina essential tasks and plays an important role in vascular, inflammatory, degenerative and dystrophic diseases of the retina and the choroid. On the other hand, it has long been known that a close interdependence between RPE and neural retina consists during normal development, but which is functionally not very well understood, although it is known that the RPE for the regeneration of the retina is important.

Es wurde übereinstimmend beobachtet, dass der Kontaktverlust der neuralen Netzhaut mit dem RPE Netzhautablösung bei vielen Vertebraten zur Degeneration der Netzhaut führt. There was consensus observed that the Schwefel Krampfadern Behandlung malyshevoy Bahnfahrten of contact of the neural retina leads to the RPE retinal detachment in many vertebrates to degeneration of the retina.

Als Nebeneffekt der Netzhautablösung wurde häufig eine starke vom RPE ausgehende Zellproliferation unterhalb der Ablösungsstellen beobachtet. As a side effect of retinal detachment strong hazards arising from the RPE cell proliferation was observed frequently below the region of separation.

Therefore, would be the identification of hypothetical survival factors for photoreceptor cells of potentially great importance for the treatment of pathological conditions that can lead to blindness due to unknown causes by photoreceptor degeneration. While these species may be due by selective photoreceptor degeneration in a number of different mechanisms have analogies with neuronal degeneration in other regions of the nervous system involved an involvement of neurotrophic activity of the retina.

Zusammenfassung der Erfindung Summary of the Invention [] [] Die vorliegende Erfindung Vessel Due F mit trophischen Geschwüren ein Verfahren zur Reinigung eines neurotrophen Faktors aus dem pigmentierten Netzhautepithel.

The present invention relates to a process for the purification of a neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel. Das Kationenaustauschchromatographiemedium wird dann gewaschen, um jegliche ungebundene Proteine zu eluieren und der neurotrophe Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel wird vom Kationenaustauschchromatographiemedium eluiert und gesammelt. The Kationenaustauschchromatographiemedium is then washed to elute any unbound proteins and the neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel is eluted and collected from the Kationenaustauschchromatographiemedium.

Furthermore, a recombinant DNA molecule is described that comprises a gene encoding a neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel with the DNA sequence or amino acid sequence in SEQ ID NO 1 and a non-human organism transformed with a recombinant DNA transformed molecule which includes a gene for the neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel with 1 defined in SEQ ID NO DNA sequence.

Accordingly, the present invention purified PEDNF, in a method of treating tumors, ocular diseases and caused by the activity of serine proteases diseases, may be used which is based on the administration of PEDNF. Kurzbeschreibung der Abbildungen Brief Description of the Drawings [] [] Die Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch das Lesen der Ansprüche und der genauen Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den im Folgenden beschriebenen Abbildungen deutlicher.

The characteristics and advantages of the invention will become more apparent by reading the Claims and the detailed description of the invention taken in conjunction with the figures described below. Molekulargewichte sind links und pH-Extremwerte oben angegeben.

Genaue Beschreibung der Erfindung Detailed Description of the Invention [] [] Zellen des pigmentierten Netzhautepithels sind in vivo eng assoziiert mit differenzierenden Retinoblasten und tragen zu einer Umgebung bei, die für ihre Entwicklung und normale Funktion sowohl in vivo als auch in vitro notwendig ist. Of the pigmented cells in vivo Netzhautepithels are closely associated with differentiating retinoblasts and contribute to an environment in which is necessary for their development and normal function both in vivo and in vitro.

Retinoblastomazellen zeigen multipotente Differenzierungseigenschaften, die denen ihrer Vorläuferzellen, den primitiven Retinoblasten, ähneln, was durch die Tatsache belegt wurde, dass Agenzien wie Laminin, Natriumbutyrat und Dibutyryl-cAMP die Ausprägung von neuronalen, gliären und Pigmentepithel-Charakteristika in vitro hervorrufen können.

Retinoblastomazellen show multipotent differentiation properties similar to those of their progenitors, the primitive retinoblasts, similar to what was evidenced by the fact that agents such as laminin, sodium butyrate and dibutyryl cAMP can induce the expression of neuronal, gliären and pigment characteristics in vitro.

A human cultured retinoblastoma cell line Y79 cells show a high degree of nerve cell-like differentiation when treated with an RPE-conditioned medium RPE-CM. Die Differenzierung wird sowohl in morphologischen als auch biochemischen Charakteristika der Zellen sichtbar. The differentiation is visible in both morphological and biochemical characteristics of the cells.

Die behandelten Zellen entsenden aus ihren Vessel Due F mit trophischen Geschwüren verzweigende neuritische Fortsätze und exprimieren erhöhte Spiegel von neuronspezifischer Enolase NSE und Neurofilament-Proteinen. The link cells send out their cell bodies branching neuritic extensions and Krampfadern und Krämpfe Behandlung elevated levels of neuro-specific enolase NSE and neurofilament proteins.

The secreted by RPE proteins have been fractionated from RPE-CM, and a protein doublet with a relative molecular weight of about 50, to about 55, which occurs exclusively in the RPE-CM is identified.

Dieser neurotrophe Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel PEDNFwelcher eines der wesentlichen sekretorischen Produkte von menschlichen fötalen RPE-Zellen ist, wurde isoliert und die neurotrophe Wirkung auf YRetinoblastomazellen gezeigt. This neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel PEDNFwhich is one of the major secretory products of human fetal RPE cells, has been isolated and shown neurotrophic effect on YRetinoblastomazellen.

PEDNF can be used for treatment of retinal diseases including but not limited to, retinoblastoma and other tumors of http://varizen247.de/schwangerschaft-mit-krampfadern-beine.php eye, retinitis pigmentosa, various forms of retinal detachment, macular degeneration, diabetic retinopathy and age-related diseases and other hereditary retinal cells.

In the case of retinal tumors PEDNF stimulates tumor cells to stamp out biochemical and phenotypic characteristics of mature neuronal cells. Solche Veränderungen werden durch den Stillstand oder die Verringerung der Zellteilungsrate deutlich, was zu Tumorrückgang oder zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums führt.

Such changes will become apparent from the stop or reduce the rate of cell division, leading to tumor regression or to a slowing of tumor growth. Im Falle von nicht-tumorösen Netzhauterkrankungen verstärken die neurotrophen Eigenschaften von PEDNF das Überleben und Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Wohlergehen von Photorezeptor- und anderen Netzhautzellen, führen zur Verlängerung ihrer funktionstüchtigen Lebensspanne und zur Senkung der Rate des Einsetzens von Sehbehinderungen und endgültiger Http://varizen247.de/gras-mit-krampfadern-der-unteren-extremitaeten.php. In the case of non-tumorous diseases of the retina enhance the neurotrophic properties of PEDNF the survival and welfare of photoreceptor and other retinal cells, leading to the extension of their functional lifespan and reduce the rate of onset of visual impairment and blindness final.

In the case of retinal detachment PEDNF prolongs the life span of photoreceptor cells sufficiently so that the retinal RPE compound may be renewed by the usual Wiederanheftungsvorgänge, whereby the normal vision is restored. Herstellung einer unreinen, neurotrophen Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel enthaltenden Proteinfraktion 1. Preparation of an impure neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel protein fraction containing [] [] Neurotrophe Faktor aus dem pigmentierten Netzhautepithel PEDNF kann aus jeglichen Geweben oder Zellen isoliert werden, die PEDNF herstellen.

Neurotrophic factor from the pigmented Netzhautepithel PEDNF can be isolated from all tissues or cells that produce PEDNF. Naturally-occurring cells that produce PEDNF are pigmented retinal epithelial cells. Solche Zellen können in Kultur gezüchtet werden, wobei sie PEDNF in das Medium, in dem sie wachsen, absondern. Such cells can be grown in culture, while in the medium in which they grow, secrete PEDNF. The medium may be harvested at regular intervals, Vessel Due F mit trophischen Geschwüren can be isolated from the medium.

Geeignete Zellkulturen können aus pigmentierten Netzhautepithelzellen von Menschen, Affen und anderen Primaten und anderen Tieren wie Hühnern, Mäusen, Ratten, Kühen und Schweinen gewonnen werden.

Suitable cell cultures may be obtained from the pigmented retinal epithelial cells of humans, monkeys and other primates and other animals such as chickens, mice, rats, cows and pigs. PEDNF may also be isolated by extraction of the interphotoreceptor matrix IPM or from the retina of humans, monkeys and other primates and other animals such as chickens, mice, rats, cows and pigs. Alternatively, PEDNF can be obtained from sources in which it does not naturally occur, such as non-human organisms transfected with a recombinant DNA molecule which is constructed so that expression of PEDNF in the host cells chosen for the expression of the gene is effectedA.

Züchtung von menschlichen pigmentierten Netzhautepithelzellen RPE A. Growth of human pigmented retinal epithelial RPE [] [] Kulturen von RPE-Zellen werden durch post-mortem-Präparation von Augen angelegt, indem die Augen unter aseptischen Bedingungen eröffnet und der Glaskörper und die Netzhaut entfernt werden. Cultures of RPE cells are created by post-mortem dissection of eyes by opening the eyes under aseptic conditions and the vitreous and the retina are removed.

RPE-Zellen werden Vessel Due F mit trophischen Geschwüren der Bruch'schen Membran geschabt und mittels eines Flüssigkeitsstrahls aus einer Pasteur- oder ähnlichen Pipette mit MEBS oder Kulturmedium abgelöst. Vor diesem Schritt kann eine Behandlung mit proteinspaltenden oder anderen Enzymen wie Dispase Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, Katalog Alternativ können RPE-Zellen isoliert werden, indem Stücke der Lederhaut des intakten Auges abgelöst werden, so dass Aderhautgewebe freigelegt wird, und diese Aderhaut-Oberfläche mit Protein-spaltenden oder anderen Enzymen wie Dispase vor der Entfernung des Glaskörpers und der Netzhaut behandelt wird und die RPE-Zellen durch Besprühen mit Zellkulturmedium wie von Click the following article beschrieben abgelöst werden.

Gewebefragmente werden in Gewebekulturschalen überführt in ein Medium wie komplettes RPEMedium mit niedrigem bzw. The exposed retina with a buffered solution as "modified Earle's Balanced Salt Solution" MEBS: RPE cells are scraped from Bruch's membrane and by means of a jet of liquid from a Pasteur or similar pipette replaced with MEBS or culture medium.

In this step, treatment with protein cleaving or other enzymes such as Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, catalog Alternatively, can be isolated RPE cells, by detached pieces of the dermis of the intact eye so that uveal tissue is exposed, and these choroidal surface Vessel Due F mit trophischen Geschwüren treated with protein-cleaving or other enzymes such as dispase prior to removal of the vitreous and the retina and the RPE cells are detached described by spraying with cell culture medium as from pepper.

At concentrations below about 0. Antibiotika und Fungizide, die geeignet für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, sind etwa 1. Diese Antibiotika können nach Belieben einzeln oder in Kombination verwendet werden.

These antibiotics may be used singly or in combination as desired. Pigmented retinal epithelial RPE cells attach themselves to the surface of culture dishes at, multiply and eventually form a monolayer grown together from.

Alternatively, RPE cells may be isolated by removing from the eyes of the cornea, the 2 mm scleral ring, and the vitreous and neural retina. The eyes are with calcium and magnesium-free "Hanks Balanced Salt Solution" HBSS: 1. The eye cup with a solution filled, which consists of about 0. The loose RPE cells are collected by gentle aspiration, and the procedure will be repeated until the RPE cells are released.

Die Zellen werden durch Zentrifugation bei etwa UpM für etwa 7 Min. The cells are collected by centrifugation at about rpm for about 7 min. Proportional more or less cells are applied when larger or smaller plates or Vessel Due F mit trophischen Geschwüren are used.

Insulin, Transferrin und Selen sind bei Collaborative Research in Lexington, MA, erhältlich. Andere Reagenzien, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wenn nicht anders vermerkt, bei Sigma Chemical Co.

The cells grow in "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" DMEMobtained from GIBCO, or grow in another suitable medium. The medium can click at this page an equal volume of HAM's F12 medium GIBCO available was added, and at about 1 mM sodium pyruvate, about Vessel Due F mit trophischen Geschwüren. Other reagents which are suitable for use in the present invention, unless otherwise stated, from Sigma Chemical Co.

Although only two methods for the culturing of RPE cells are described, other suitable methods for culturing RPE cells are known in the art. Solche Verfahren sind auch für die Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Such methods are also suitable for use in the present invention.

Herstellung von durch pigmentierte Netzhautepithelzellen konditioniertem Medium RPE-CM B. Preparation of conditioned medium by pigmented retinal epithelial RPE-CM [] [] PEDNF ist ein Protein, das abgesondert wird und RPE-Zellen sondern PEDNF in das Medium ab, in dem sie wachsen. PEDNF is a protein that is secreted and RPE cells but PEDNF into the medium from where they grow.

Therefore, it is a simple process for the preparation of PEDhTF to grow RPE cells in culture and harvesting the medium of these cultures at regular intervals. A method for isolating PEDNF from medium that is suitable for use Qualitätssicherung Hagebutten mit Krampfadern bin the present invention is to allow RPE cells to grow until a dense cell lawn, in a medium such as DMEM mixed with about 1 mM sodium pyruvate, about 0.

The dense cell lawn of RPE cells are washed extensively with "Hank's Balanced Salt Solution", or other suitable wash solutions, to remove serum proteins from the fetal calf serum contained in the medium for culturing the RPE cells.

Approximately 1 ml per cm 2 of cell surface serum-free medium such as DMEM supplemented with about 1 mM sodium pyruvate, about 0. In another embodiment, PEDNF may be composed of serum containing medium such as DMEM supplemented with about 1 mM sodium pyruvate, about 0. The medium is then collected by the medium is poured into plastic centrifuge tubes and the medium is centrifuged at about 3, rpm for about 10 min.

Isolierung von PEDNF aus Gewebe rohen C. Isolation link crude PEDNF from tissue [] [] PEDNF kann direkt aus Augen isoliert werden indem die Augen eröffnet werden und der Glaskörper Vessel Due F mit trophischen Geschwüren die Netzhaut entfernt werden. PEDNF demnächst 3 Varizen Grad als zur Behandlung von Forensic be isolated directly from eyes Vessel Due F mit trophischen Geschwüren link eyes shall be opened and the vitreous and the retina are removed.

Das pigmentierte Netzhautepithel wird mittels eines Einweg-Zellschabers von der Bruch'schen Membran Vessel Due F mit trophischen Geschwüren. The pigmented Netzhautepithel is scraped by means of a disposable cell scraper of Bruch's membrane.

Die Lösung wird dann bei etwa Der PEDNF enthaltende Überstand wird gesammelt, wodurch man eine unreine PEDNF-Proteinlösung erhält. Tissue fragments are transferred to a Teflon or glass homogenizer in 10 mM "Phosphate Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Saline" PBS and homogenized to disrupt the cells. The solution is then stirred at about 10, rpm for about 10 min.

Centrifuged and filtered to the cell debris Remove to. The PEDNF containing supernatant was collected, thus obtaining an impure PEDNF protein solution. Isolierung von PEDNF aus rekombinanten Zellen D. Isolation of PEDNF from recombinant cells [] [] PEDNF kann auch aus rekombinanten Zellen isoliert werden, welche so konstruiert wurden, dass sie das PEDNF-Gen exprimieren. PEDNF may also be isolated from recombinant cells which Vessel Due F mit trophischen Geschwüren been engineered to express the PEDNF Vessel Due F mit trophischen Geschwüren. Der PEDNF kann als intrazelluläres oder extrazelluläres Protein exprimiert werden.

The PEDNF can be expressed as an intracellular or extracellular protein. Intracellular PEDNF is isolated by the cells Vessel Due F mit trophischen Geschwüren be contained in a Dounce or other suitable homogenizer in a buffer such as PBS, the detergents or other solubility-promoting agents such as urea or guanidinium hydrochloride, can be homogenized, and then at about 10, rpm for about 20 min be centrifuged. Extracellular PEDNF is isolated by the medium in which the PEDNF expressing cells grow you gather.

Dies wird am einfachsten in einem kontinuierlichen Zentrifugationsverfahren, Definitions Was ist die effektivste Creme Krampf Broadband mittels einer Sharples-Zentrifuge, durchgeführt.

This is most easily carried out in a continuous centrifugation method, such Vessel Due F mit trophischen Geschwüren by means of a Sharples centrifuge.

Der Überstand wird gesammelt, wodurch man eine unreine PEDNF-Proteinlösung erhält. The supernatant was collected, thus obtaining an impure PEDNF protein solution.

Reinigung von PEDNF 2. Purification of PEDNF A. Purification of PEDNF small scale i. An impure PEDNF protein fraction can be partially purified by ammonium sulfate precipitation, thereby obtaining a purified by ammonium sulfate PEDNF protein fraction.

Das Ammoniumsulfat wird vorzugsweise langsam zu der unreinen Proteinfraktion gegeben, während die Lösung zum Beispiel mit einem Rührstab oder auf einem mechanischen Rührgerät gerührt wird. The ammonium sulfate is preferably added slowly to the impure protein fraction while the solution is stirred for example with a stir bar or a mechanical stirrer.

Das Ammoniumsulfat wird langsam zugegeben, um lokal hohe Konzentrationen von Ammoniumsulfat zu verhindern, was zu einer schnellen Ausfällung und Denaturierung von Proteinen in der unreinen Proteinfraktion führen kann. The ammonium sulfate is added slowly to avoid locally high concentrations of ammonium sulphate, which can lead to a rapid precipitation and denaturation of proteins in the impure protein fraction. Der Überstand wird zur weiteren Verarbeitung gesammelt.

The supernatant is collected for further processing. In diesem Fall wird das Filtrat für die weitere Verarbeitung gesammelt. In this case, the filtrate is collected for further processing. Purification of PEDNF on a small scale is carried out by means of SDS-polyacrylamide slab gels.

Solche SDS-Polyacrylamidgele sind im Fachgebiet sehr gut bekannt und die Präparation von solchen Gelen wurde beschrieben von Weber und Osborn, J. Such SDS polyacrylamide gels are well known in the art and the preparation of such Vessel Due F mit trophischen Geschwüren has been described by Weber and Osborn, J. Samples of an impure PEDNF protein fraction or ammonium sulfate purified PEDNF on protein fraction are dialyzed against a buffer such as 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.

Zu den zusätzlichen Proben, die auf das Gel aufgetragen werden gehören auch Molekulargewichts-Standards wie Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carboanhydrase, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Lysozym erhältlich zum Beispiel von Bio-Rad, Katalog und Kontrollen soweit notwendig.

To additional samples that are applied to the gel and molecular weight standards such as phosphorylase B, bovine serum albumin, ovalbumin, carbonic anhydrase, soybean trypsin inhibitor and lysozyme include available for example from Bio-Rad, catalogand controls as necessaryFalls konditionierte Medien als Proben verwendet werden, dienen Medien, die nicht mit den RPE-Zellen in Kontakt waren unkonditionierte Medien als Kontrollen.

If conditioned media are used as samples are media that were not with the RPE cells in contact unconditioned media as controls.

The samples are then heated in a boiling water bath for about 5 min. And applied to SDS-Polyacrylamidplattengele. Die Markierungsproben und die nicht-konditionierten Medien werden in die Geltaschen am Rand Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Gels aufgetragen und die unreinen PEDNF-Fraktionen oder die über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion werden in die verbleibenden inneren Geltaschen aufgetragen.

The marking samples and the non-conditioned media may be applied to the gel pockets at the edge of the gel, and the impure PEDNF fractions or the ammonium sulfate purified PEDNF over-protein fraction can be applied in the remaining Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gel pockets. Die Proben werden dann der Elektrophorese unterzogen. The samples are then subjected to electrophoresis. Die Elektrophorese wird fortgesetzt bis der Bromphenolblau-Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hat.

The electrophoresis is continued until the bromophenol blue dye reaches the bottom of the gel. Nach Abschluss der Elektrophorese werden Streifen von jeder Seite des Gels mit den Markierungsproben und je eine Spur mit der unreinen PEDNF-Proteinfraktion und einer Kontrolle mit nicht-konditioniertem Medium mit Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gefärbt.

After completion of electrophoresis strips from each side of the gel with the marking Vessel Due F mit trophischen Geschwüren and one track with the impure protein fraction PEDNF and a control with non-conditioned medium stained with Coomassie blue. Die gefärbten Proteinbanden, die auf den gefärbten Gelstreifen erscheinen, werden an den ungefärbten Teil des Gels angelegt, so dass die Position der Proteine abgelesen werden kann, die in der unreinen PEDNF-Proteinfraktion oder in der über Ammoniumsulfat gereinigten PEDNF-Proteinfraktion vorhanden sind, jedoch im Kontrollmedium fehlen.

The stained protein bands which appear on the stained gel strips are applied to the undyed portion of the gel, so that the position of the proteins can be read, which are present in the impure PEDNF protein fraction or in the above ammonium sulfate purified PEDNF protein fraction, but absent in the control medium. A PEDNF protein doublet band with a relative molecular weight of about 50, to about 55, which is unique to the impure PEDNF-protein fraction is excised and the proteins source electroeluted using known methods in the art from the unstained portion of the gel.

The eluate is centrifuged to remove gel fragments and the supernatant dialyzed against 10 mM "Phosphate Buffered Saline" mM NaCl, 8. Reinigung von PEDNF durch Kationenaustauschchromatographie Cleaning of PEDNF by cation exchange chromatography [] [] Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird gegen Wasser oder gegen einen Puffer wie 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, oder einen anderen geeigneten Puffer dialysiert, um Medium und Salze aus der unreinen Proteinprobe zu entfernen.

An impure PEDNF Group or via ammonium sulfate purified PEDNF-protein fraction was dialyzed against water or against a buffer such as 10 mM phosphate buffer, pH 7.

PEDNF may be by means of cation exchange HPLC purified using a Säulenchromatographiemediums, such as sold under the trade name "Brownlee Aquapore CX" in Western Analytical, Temecula, CA, commercially available, in a column such as a 4. The chromatographic medium is a buffer such as 10 mM phosphate, pH 7.

Die dialysierte unreine PEDNF-Proteinfraktion oder über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird auf das Chromatographiemedium aufgebracht und das Chromatographiemedium mit dem daran gebundenen PEDNF wird mit einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,2, gewaschen bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen sind.

The dialyzed impure PEDNF protein fraction or ammonium sulfate purified PEDNF protein fraction is applied to the chromatographic medium, and the chromatography medium with PEDNF bound to it is with a buffer such as 10 mM phosphate, pH 7. PEDNF is eluted from the chromatography medium with a linear salt gradient from about 0. PEDNF eluiert als einzelner Peak bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,25 M.

PEDNF eluted as a single peak at visit web page NaCl concentration of about 0. The eluted PEDNF is concentrated by lyophilization, and Vessel Due F mit trophischen Geschwüren in water or a buffer such as 10 mM phosphate, pH 7. Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC Purification of PEDNF by Reverse-Phase HPLC [] [] Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird gegen Wasser oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, oder einen anderen geeigneten Vessel Due F mit trophischen Geschwüren dialysiert, um Medium und Salze aus der unreinen Proteinprobe zu entfernen.

An impure PEDNF Group or via ammonium sulfate purified PEDNF protein fraction was dialyzed against water or against a buffer such as 10 mM phosphate buffer, pH 7. PEDNF may be by means of reverse phase HPLC are purified using a Säulenchromatographiemediums, such as sold under the trade name "Vydac C8" by The Separation Group, Hesperia, CA, commercially available, packed in a column such as a 4. The chromatography medium is equilibrated with a solution such as about 0.

Die dialysierte unreine PEDNF-Proteinfraktion oder über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion wird auf das Chromatographiemedium aufgebracht und das Chromatographiemedium mit dem daran gebundenen PEDNF wird mit einer Elutionslösung wie 0,1 Volumenprozent TFA gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen sind.

The dialyzed impure PEDNF protein fraction or ammonium sulfate purified PEDNF protein fraction is applied to the chromatographic medium, and the chromatography medium with PEDNF bound to it is washed with an elution solution, such as 0.

PEDNF is from the chromatography medium with a linear gradient of about 0. The eluted PEDNF is concentrated by lyophilization and then taken up in water or a buffer such as 10 mM phosphate, pH 7. An impure PEDNF Group, one Vessel Due F mit trophischen Geschwüren ammonium sulfate purified PEDNF protein fraction, a purified by cation exchange HPLC PEDNF protein fraction or purified by reverse phase HPLC PEDNF protein fraction can be further purified by size exclusion using a chromatography medium, such as sold under the trade name "Bio-Rad TSK" from Bio-Rad, Richmond, CA, available in a column such as a 7.

PEDNF containing fractions are collected and dialyzed against a Vessel Due F mit trophischen Geschwüren such as 10 mM phosphate, pH 7. Heparin-Chromatographie Heparin chromatography [] read more Eine unreine PEDNF-Fraktion oder eine über Ammoniumsulfat gereinigte PEDNF-Proteinfraktion kann auch mittels Heparin-Chromatographie gereinigt werden.

An impure PEDNF Group or via ammonium sulfate purified PEDNF-protein fraction can also be purified by heparin chromatography. Ein Heparin-Chromatographiemedium wie Heparin-Agarose, bei Sigma Chemical Co. H erhältlich, wird in einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert. A heparin chromatography medium such as heparin-agarose, obtained from Sigma Chemical Co.

H is dissolved in a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7. An impure PEDNF fraction or an ammonium Vessel Due F mit trophischen Geschwüren purified PEDNF on protein der gehen Varizen Verbesserung is dialyzed against a buffer read article as 10 mM Tris, pH 7. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die äquilibrierte Heparin-Agarose aufgebracht wurde, wird click the following article Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Just click for source von der Heparin-Agarose eluiert sind.

After the PEDNF solution has been applied to the equilibrated heparin agarose, the heparin agarose is washed with a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7. PEDNF wird dann von der Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl eluiert. Vessel Due F mit trophischen Geschwüren is then eluted from the heparin agarose with a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7.

The eluate containing PEDNF is then diafiltered in an "Amicon Diaflo" -Ultrafiltrationseinheit or against a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7. For the purification procedure described above PEDNF impure fractions or purified ammonium sulfate PEDNF protein fractions can be used as a starting material for the subsequent column purification.

In einer anderen Ausführungsform kann auch eine Proteinfraktion, Vessel Due F mit trophischen Geschwüren bereits durch eine oder mehrere der beschriebenen Chromatographieschritte gereinigt wurde, verwendet werden.

In another embodiment, a protein fraction which has already been purified by one or more of the chromatography steps described, may be used.

Daher können die Reinigungsverfahren allein oder in Kombination miteinander oder mit anderen im Fachgebiet bekannten Reinigungsverfahren verwendet werden, um eine PEDNF-Fraktion der gewünschten Reinheit zu erhalten.

Therefore, the purification procedures may be used alone or in combination with each other or with other purification procedures known in the art, to obtain a PEDNF fraction of the desired purity. Preparation of PEDNF on a large scale i. Purification of PEDNF on a large scale may be accomplished by ammonium sulfate precipitation, thereby obtaining a purified by ammonium sulfate PEDNF protein fraction.

Das Filtrat wird für die weitere Verarbeitung gesammelt. The filtrate is collected for further processing. Anionenaustauschchromatographie Anion exchange chromatography [] [] Vessel Due F mit trophischen Geschwüren pI isoelektrische Punkt des PEDNF-Proteins liegt bei etwa 3,9 bis etwa 7,2.

The pI isoelectric point of the PEDNF protein is about 3. Daher hat das Protein bei einem pH-Wert von etwa 7,5 eine Netto-Negativladung und bindet an ein Anionenaustauschchromatographiemedium wie DEAE Diethylaminoethyl -Cellulose. Therefore, the protein at a pH of about 7. For the use of an anion-exchange chromatographic such as DEAE-cellulose is with a buffer such as 10 mM Tris, pH 7.

The PEDNF is applied to the anion-exchange chromatographic medium and are eluted with a buffer such as 10 mM phosphate, pH 7. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Salzgradienten von etwa 0 bis etwa 1 M NaCl in einem Puffer wie etwa 10 mM Phosphat, pH 7,5, eluiert. After all the unbound proteins are eluted, PEDNF is eluted with a linear salt gradient from about 0 to about 1 M NaCl in a buffer such as 10 mM phosphate, pH 7.

Die PEDNF enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und vereinigt. The fractions containing PEDNF are collected and pooled. Diese Fraktionen werden dann check this out oder gegen einen Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, um NaCl zu entfernen, wodurch man eine durch Anionenaustauschchromatographie gereinigte PEDNF-Proteinfraktion erhält.

These fractions are then diafiltered or dialyzed against a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7. The anion exchange chromatography may be carried out either in a batch process or by column chromatography procedures.

For the purification of PEDNF on a large scale even a heparin chromatography may be used. Ein Heparin-Chromatographiemedium wie Heparin-Agarose, erhältlich bei Sigma Chemical Co. H wird mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert. H is mixed with a buffer such as 10 mM Tris, pH 7. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die Heparin-Agarose aufgebracht wurde, wird die Heparin-Agarose mit einem Puffer wie etwa 10 mM Tris-HCl, Vessel Due F mit trophischen Geschwüren 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Heparin-Agarose eluiert sind.

After the PEDNF solution has been applied to the heparin agarose, the heparin agarose is washed with a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7. The eluate containing PEDNF is collected and diafiltered in an "Amicon Diaflo" -Ultrafiltrationseinheit or against a buffer such as 10 mM Tris-HCl, pH 7. Testung von PEDNF 3. Testing of PEDNF A. PEDNF can be identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, for example, in 7. Die Herstellung solcher Gele wurde von Weber und Osborn beschrieben und von Lämmli modifiziert und die Herstellung und Verwendung solcher Gele sind im Fachgebiet sehr gut bekannt.

The preparation of such gels has been described by Weber and Osborn and modified by Laemmli, and the preparation and use of such gels are well known in the art. PEDNF protein samples are about 5. Molekulargewicht- Markierungsproben, die Molekulargewicht-Standards wie Vessel Due F mit trophischen Geschwüren B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carboanhydrase, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Lysozym erhältlich zum Beispiel von Bio-Rad, Katalog beinhalten, werden als Kontrollen mitgeführt.

Molekulargewicht- Marker samples, molecular weight standards such as phosphorylase B, bovine serum Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, ovalbumin, carbonic anhydrase, soybean trypsin inhibitor and lysozyme available for example from Bio-Rad, catalog include, be included as a controls. Die PEDNF-Proteinproben und die Molekulargewicht-Standards werden für etwa 5 Min. The PEDNF protein samples and the molecular weight standards are boiled for about 5 min.

The samples are then subjected to electrophoresis until the bromophenol blue dye reaches the bottom of the gel. Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Gel mit Silber, Coomassie-Blau oder einem anderen geeigneten Proteinfärbeverfahren gefärbt. After completion of the electrophoresis, the gel with silver, Coomassie blue or another suitable Proteinfärbeverfahren is colored. Das Molekulargewicht der Proteine in der PEDNF-Probe wird dann mit den Molekulargewicht-Standards verglichen.

The molecular weight of proteins in the PEDNF sample is then compared to the molecular weight standards. PEDNF migrates in SDS-polyacrylamide gels as a protein doublet band with a relative molecular weight Vessel Due F mit trophischen Geschwüren about 50, to about 55, Neural inductance [] [] PEDNF-Aktivität in Proteinproben kann aufgrund seiner neuronalen Induktivität getestet werden.

PEDNF activity in protein samples can be tested because of its neural inductance. Verschiedene Konzentrationen von PEDNF werden zu Kulturen von Y79 Retinoblastoma RB Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gegeben, erhältlich bei American Type Culture Collection, Zugangsnr. Various concentrations of PEDNF are added to cultures of Y79 retinoblastoma RBwhere cells, available from American Type Culture Zur Verhütung Krampfadern an den Beinen, accession no.

HTB 18, more info Rockville, MD. HTB 18 in Rockville, MD. Die Y79 RB-Zellen wachsen als Suspensionskultur. The RB-Y79 cells grown in suspension culture.

Die Zellen werden durch Zentrifugation für etwa 5 Min. The cells are harvested by centrifugation for about 5 min. The poly-D-lysine-coated bottles are produced by they obtainable, for. Die Experimente werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und zweimal wiederholt. The experiments are performed in triplicate and repeated twice. Target about 15 Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, or about the size of a cell.

The presence of PEDNF in the protein sample results in Y79 RB cells send axon extensions. Differenzierung Differentiation [] [] Die Zellen wurden wie oben beschrieben gezüchtet. The cells were grown as described above. Der Prozentsatz der differenzierenden Zellen wird abgeschätzt, indem die Zahl der zellulären Aggregate mit fünf oder mehr Zellen, die neuritische Auswüchse nach 8—10 Tagen der Kultur auf einem Poly-D-Lysin-Substrat zeigen, berechnet kaufen von Krampfadern. The percentage of differentiating cells is estimated is by the number of cellular aggregates with five or more cells, the neuritic outgrowths after days of culture show on a poly-D-lysine substrate is calculated.

Charakterisierung des PEDNF-Proteins 4. Characterization of the protein PEDNF A. Isolierung von PEDNF-Pentiden A. About ug of purified PEDNF is concentrated in Centricon 10 microconcentrators Amicon, Danvers, MA and then diluted in an appropriate buffer, such as cleavage of 25 mM Tris, pH 8. Zu der Proteinprobe wird ein proteolytisches proteinspaltendes Enzym wie Endoproteinase Lys-C, erhältlich bei Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, gegeben.

To the protein sample a proteolytic protein-splitting enzyme as endoproteinase Lys-C, available is given at Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN.

In einer anderen Ausführungsform kann das Protein mit Trypsin in einem Puffer, der aus etwa 10 mM PBS besteht, oder unter Verwendung von anderen auf dem Fachgebieten bekannten Proteasen gespalten werden.

In another embodiment, the protein with trypsin Vessel Due F mit trophischen Geschwüren a buffer consisting of about 10 mM PBS or by using other techniques known in the fields of proteases can be cleaved.

The resulting PEDNF polypeptide fragments are separated on a Vydac C8 reverse phase column using a separation system such as HPLC. The column is equilibrated with about 0. The eluted from the column polypeptides that are well separated from other polypeptides are collected and subjected to protein sequence analysis.

Proteinsequenzanalyse For example, protein sequence analysis [] [] Die gereinigten Polypeptidfragmente werden der Aminosäuresequenzanalyse mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren unterzogen. The purified polypeptide fragments are subjected to amino acid sequence analysis using known methods in the art. In einer anderen Ausführungsform wird die Aminosäuresequenzanalyse einfach im Auftrag bei einem Anbieter für Aminosäuresequenzierungen durchgeführt, wie zum Beispiel bei der Mikrosequenzierungseinrichtung des Beckman Forschungsinstituts am City of Hope in Duarte, CA.

In another embodiment, the amino Becher Krampfadern sequence analysis is easily performed in order with a supplier for amino acid sequencing, such as in micro-sequencing facility of the Beckman Research Institute at City of Hope in Duarte, CA.

Charakterisierung des PEDNF-Gens 5. Characterization of the gene PEDNF A. Klonierung des PEDNF-Gens A. The oligonucleotides are as primers for the polymerase chain reaction PCR using a Techne thermal cycler and standard of reagents and methods available Mama Behandlung Thrombophlebitis the brand name "GeneAmp" from Perkin Elmer Cetus, Emeryville, CA, prepared.

A Charon BS cDNA library derived from human fetal eye is screened with the PCR method using a Techne thermal cycler and standard reagents and procedures. In: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Therefore, the reconstituted solution contains about mM KCl, Die Lösungen werden dann auf die gewünschte Primeranlagerungstemperatur eingestellt. The solutions are then adjusted to the Vessel Due F mit trophischen Geschwüren primer Vessel Due F mit trophischen Geschwüren temperature. After the solutions Vessel Due F mit trophischen Geschwüren adjusted to the desired primer annealing temperature, about 1.

Der Zyklus wird insgesamt etwa 25 bis etwa 30 Mal durchlaufen. The cycle is a total of about 25 to about 30 times through. Am Ende des letzten Zyklus wird ein letzter Primerverlängerungsschritt für etwa 7 Min. At the end of the last Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, a Vessel Due F mit trophischen Geschwüren primer extension step for about 7 min.

The fragment is labeled with 32 P by "random priming" using a kit, which is available under the trade name "Prime-It Random Primer Labeling Kit" from Stratagene. Die markierte Sonde wird verwendet, um etwa The labeled probe is used to scan from aboutplaque forming units of the Charon BS cDNA library by methods known in the art. Positive clones are isolated and the DNA was purified with reagents, available under the brand Fraktion 2 ASD Anwendung trophischen Geschwüren "Qiagen Maxi" from Qiagen Inc.

The inserts in the click vector can be cut out with a suitable cleaving enzyme, closed with T4 ligase from New England Biolabs, Beverly, MA to the ring and into competent E.

White colonies are selected and worked up by "mini preparation" with a Qiagen plasmid Minipräparationsreagenz from Qiagen. The purified plasmids are digested to excise the insert, and the fragments are separated by gel electrophoresis to determine the size of the inserts. One clone with an insert of the correct size is then selected for further study. DNA Sequence Analysis [] [] Die Sequenzanalyse wird mit einem automatischen Sequenzierer oder mittels anderer im Fachgebiet wohlbekannter Verfahren durchgeführt.

Sequence analysis is performed with an automated sequencer or by other methods well known in the art. Expression des PEDNF-Gens in rekombinanten Zellen 6. A commercial preparation of PEDNF or a large-scale production can, after cloning into a suitable vector, effected by expressing the gene in a suitable host cell.

Generally, such vectors comprise the polyhedrin promoter of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus AcNPVwhich is inserted into the transfer vector, such. As pAC, described by Summers and Smith A Manual for baculovirus vector and insect cell culture procedures, Texas Agric. Rekombinante Plasmide werden durch Verfahren hergestellt, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie diejenigen, die beschrieben werden bei Maniatis et al. Recombinant plasmids are prepared by methods which are well known in the art, such as those described in Maniatis et al.

The host cells such as S. The Sf9 cells are co-transfected with infectious AcNPV DNA from about 1 ug and about 50 ug of recombinant DNA. Die Kulturüberstände werden etwa 4 Vessel Due F mit trophischen Geschwüren nach Transfektion geerntet.

Culture supernatants are harvested about 4 days after transfection. Rekombinante Viren werden durch Plaque-Hybridisierung oder durch radioaktive Markierung der hergestellten Proteine identifiziert. Recombinant viruses are identified by http://varizen247.de/bein-varizen.php hybridization or radiolabelling of the proteins produced. Andere Expressionssysteme sind im Fachgebiet bekannt; Other expression systems are known in the art; zum Beispiel wurde Saccharomyces cerevisiae in Verbindung mit einer Reihe von Vektoren benutzt, wie diejenigen, die beschrieben wurden von Silar et al.

For example, Saccharomyces cerevisiae has been used in conjunction with a series of vectors, such as those described by Silar et al. Ein beliebiges dieser oder anderer im Fachgebiet bekannten Verfahren ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Expression des PEDNF-Gens geeignet. Any of these or other methods known in the art is suitable for use in the present invention for expression of the PEDNF gene.

Der so isolierte PEDNF wird dann nach den oben beschriebenen Verfahren gereinigt. The PEDNF so isolated is then purified by the methods described above. Behandlung mit PEDNF 7. Treatment with PEDNF A. Behandlung von Tumoren A. Treatment of Tumors [] [] PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren verabreicht. PEDNF is administered, alone or in conjunction with other clinical such as surgical procedures. PEDNF wird durch Injektion in den Glaskörper intravitrealunter die Netzhaut subretinalintravenös oder intramuskulär oder aber durch Injektion oder Anwendung an den Orten des Tumorwachstums verabreicht.

PEDNF is by injection into the vitreous intravitrealunder the retina subretinalintravenously or intramuscularly or by injection or application to the sites of tumor growth. PEDNF kann allein oder in Verbindung mit Stoffen wie Polymilchsäure verabreicht werden, welche eine langsame, zeitlich verzögerte Freisetzung von PEDNF fördert.

PEDNF may be administered alone or in conjunction with materials such as polylactic acid, which promotes a slow, time-delayed release of PEDNF. Treatment with PEDNF is Vessel Due F mit trophischen Geschwüren in tumors of the retina as Retinoblastoma in neural tumors such as neuroblastoma tumors or non-neuronal origin.

Die Behandlung führt zum Stillstand oder Rückgang der Zellteilungsrate und einer damit einhergehenden Verminderung der Tumorwachstumsrate, was wiederum zum Tumorrückgang führt. The treatment leads to a halt or decrease the rate of cell division Vessel Due F mit trophischen Geschwüren a concomitant reduction in the rate of tumor growth, which in turn leads to tumor regression.

Neurotrophe Behandlung von Erkrankungen des Auges B. Neurotrophic Treatment of diseases of the eye [] [] PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren verabreicht.

PEDNF wird durch Injektion in den Glaskörper intravitreal oder unter die Netzhaut subretinal verabreicht. PEDNF is administered by injection into the vitreous intravitreal or under the retina subretinal. Treatment with PEDNF aims to diseases of the neural Vessel Due F mit trophischen Geschwüren of pigmented Netzhautepithels or other eye disorders. Die Behandlung verbessert das Überleben und Wohlergehen der Photorezeptorzellen und anderer Zellen des Auges, verlängert ihre funktionstüchtige Lebensspanne und verzögert das Einsetzen von Sehstörungen und endgültiger Erblindung.

The treatment improves Creme und Krampfadern Reiser and well-being of photoreceptor cells and other cells of the eye, extending their functional lifespan and delays the onset of visual impairment and blindness final. Neurotrophe Behandlung von verletzten Nerven C. Neurotrophic treatment of injured nerves [] [] PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren verabreicht.

PEDNF wird durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion oder aber durch Anwendung oder Injektion an Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Orten der Nervenverletzung verabreicht. PEDNF is administered by intravenous or intramuscular injection, or by application or injection at the sites sind Volks Rezepte für die Behandlung von Krampfadern ist nerve injury.

Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Regeneration der Nerven abgeschlossen ist. Treatment is continued until nerve regeneration is completed.

Treatment with PEDNF aims to nerve injury. Die Behandlung führt zur Förderung des Auswachsens von Neuriten und zur Regeneration von Nerven. The treatment results in promoting outgrowth of neurites and nerve regeneration. Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit Serinproteasen D. Treatment of diseases associated with serine proteases [] [] PEDNF ist ein Serinproteaseinhibitor. PEDNF is a serine protease inhibitor. Als solcher ist er wirksam bei der Behandlung von Erkrankungen, die durch Serinproteasen hervorgerufen werden oder bei denen ein Serinproteaseinhibitor von Vorteil wäre.

As such, it is effective in the treatment of diseases which are caused by serine proteases or which have a serine protease inhibitor would be advantageous. Serine proteases include, but not limited to, chymotrypsin, trypsin, subtilisin, elastin, thrombin, and plasmin. For use as anticoagulants, as Vessel Due F mit trophischen Geschwüren inhibitors, as anti-microbial, as antiparasitic agent and as a contraceptive, or in Vessel Due F mit trophischen Geschwüren of elastosis, vascular disorders with Fibrinoiderzeugung, coagulation disorders, arteriosclerosis, ischemia, diabetic osteoarthritis, emphysema, arthritis, septic shock, lung diseases, excessive complement activationinflammation of the pancreas, psoriasis, fibrinolytic disorders, joint diseases, bone resorption, high blood pressure, here failure due to vascular occlusion, or cirrhosis induced by proteases allergies, PEDNF is administered by intravenous or intramuscular injection or local injection or application.

For use in cosmetic preparations Vessel Due F mit trophischen Geschwüren a proteinase inhibitor, arthritis or elastosis PEDNF is added in a concentration of about 0. Vessel Due F mit trophischen Geschwüren use as weight gain conveyor and for the treatment of ulcers, colon ulcers or inflammations of the pancreas, PEDNF may be administered orally, at a concentration of about 0.

For use in the treatment of diseases such as psoriasis, PEDNF may be administered topically in a suitable carrier substance prepared in a concentration of about 0.

Beispiel 1 Example 1 Anlegen von RPE-Zellkulturen Creating RPE cell cultures [] [] RPE-Zellen wurden aus menschlichen Augen post-mortem gewonnen, wie von Pfeffer beschrieben. RPE cells were obtained from post-mortem human eyes, as described by Pfeffer Beispiel 2 Example 2 Herstellung von RPE-konditioniertem Medium Preparation of RPE-conditioned medium [] [] Zusammengewachsene Kulturen von RPE-Zellen wurden vor der Konditionierung ausgiebig mit Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gewaschen, um Serumproteine zu entfernen.

Together grown Vessel Due F mit trophischen Geschwüren of RPE cells were washed extensively with HBSS before conditioning, to remove serum proteins.

Das konditionierte Medium wurde dann gesammelt und bei 1. The conditioned medium was then collected and centrifuged at 1, rpm at room temperature to remove any free cells and other ist Varizen in bei, Vessel Due F mit trophischen Geschwüren obtaining an impure PEDNF protein fraction. Beispiel 3 Example 3 Reinigung von PEDNF durch SDS-Gelelektrophorese Purification of PEDNF by SDS gel electrophoresis [] [] Proteine, die in von menschlichen fötalen RPE konditioniertem Medium, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, und Vessel Due F mit trophischen Geschwüren nicht-konditioniertem Medium enthalten sind, wurden auf einem SDS-Polyacrylamidplattengel analysiert.

Proteins in conditioned medium from human fetal RPE prepared as described in Example 2, and included in non-conditioned medium were analyzed on an SDS-polyacrylamide slab gel.

The conditioned and non-conditioned media samples were mixed with an electrophoresis sample buffer Molekulargewichts-Markierungsproteine, wie Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Carboanhydrase, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Lysozym erhältlich zum Beispiel von Bio-Radwurden ebenfalls mit einem Elektrophorese-Probenpuffer gemischt. Molecular weight marker proteins such as phosphorylase B, bovine serum albumin, ovalbumin, carbonic anhydrase, soybean trypsin inhibitor and lysozyme available for example from Bio-Radwere also mixed with an electrophoresis sample buffer.

In a boiling water bath and continue reading onto an SDS-containing 7. Die Elektrophorese wird bei 20 mA durchgeführt, bis die Bromphenolblau-Farbmarkierung zum unteren Ende des Gels gewandert war. Electrophoresis is carried out at 20 mA until the bromophenol blue had migrated to the color marking the lower end of the gel. After completion of electrophoresis strips were stained by each outer side of the gel with the marking samples and one track with conditioned and non-conditioned medium with Coomassie blue.

Die gefärbten Proteinbanden, die auf den gefärbten Gelstreifen erschienen, Vessel Due F mit trophischen Geschwüren an den ungefärbten Teil des Gels angelegt, so dass die Position der Proteine abgelesen werden kann, die im konditionierten Vessel Due F mit trophischen Geschwüren vorhanden sind, jedoch im nicht-konditioniertem Medium fehlen. The stained protein bands which appeared on the stained gel strips were applied to the unstained portion of the gel, so that the position of the proteins can be read, which are present in conditioned medium but absent from the non-conditioned medium.

The PEDNF protein doublet band with a relative molecular weight of about 50, to about 55, which was unique to the RPE-CM was excised and the proteins were electroeluted from the unstained portion of the gel.

Ein Streifen desselben Gels, der aus der Region ausgeschnitten wurde, die Rinderserumalbumin enthielt, wurde gleich behandelt, um als Kontrolle zu dienen. A strip of the same gel, which was cut out of the region containing bovine serum albumin was treated identically to serve as a control.

Das Eluat wurde zentrifugiert, um Gelfragmente zu entfernen und der Überstand wurde dialysiert und durch Gelelektrophorese analysiert, um seine Reinheit zu überprüfen.

The eluate was centrifuged to remove gel fragments and the supernatant was dialyzed and analyzed by gel electrophoresis to verify its purity. Das Elektrophoresemuster der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ist in The electrophoretic pattern of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is in 1 1 dargestellt. The electrophoresis patterns of human fetal RPE-CM and non-conditioned control medium show the presence of a conspicuous PEDNF double band with a molecular weight of about 50, to about 55, which is found exclusively in the conditioned medium.

An impure PEDNF protein fraction, prepared as described in Example 2 was divided into six 10 ml samples. Die Proben wurden durchmischt bis das Ammoniumsulfat vollständig aufgelöst war. The samples were mixed until the ammonium sulfate was completely dissolved. Die Niederschläge, die sich in jedem Röhrchen bildeten, wurden durch Zentrifugation bei The precipitates which formed in each tube were collected by centrifugation at 10, rpm for 20 Vessel Due F mit trophischen Geschwüren. Die Niederschläge wurden in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, resuspendiert Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gegen 2 l 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5 für 24 Stunden dialysiert.

The precipitates were dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7. The results are summarized in Table Vessel Due F mit trophischen Geschwüren. Die Proben wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. The samples were prepared as described in Example 3, subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The ammonium sulfate was added slowly to the impure protein fraction while the solution was stirred with a stir bar on a mechanical stirrer.

Der Überstand wurde gesammelt. The supernatant was collected. The samples were prepared as described in Example Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis subjected. Beispiel 6 Example 6 Kationenaustauschchromatographie Cation exchange [] [] RPE-CM, hergestellt Vessel Due F mit trophischen Geschwüren in Beispiel 2 beschrieben, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert, um Medium und Salze aus der unreinen Proteinprobe zu entfernen.

RPE-CM, prepared as described in Example 2, was dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6. The dialyzed PEDNF sample was then applied to a Brownlee Aquapore CX HPLC chromatography medium, which was packed into a 4. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 10 mM Phosphat, pH 6,5, äquilibriert. The check this out medium was previously equilibrated with 10 mM phosphate, pH 6.

Das dialysierte RPE-CM wurde auf das Vessel Due F mit trophischen Geschwüren aufgebracht und das Chromatographiemedium mit dem PEDNF wurde mit 10 mM Phosphat, pH 6,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine vom Chromatographiemedium abgewaschen waren. The dialyzed RPE-CM was applied to the chromatographic medium, and the chromatography medium with PEDNF was washed with the 10 mM phosphate, pH 6. PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Salzgradienten von etwa 0,0 bis etwa 0,5 M NaCl in 10 mM Phosphat, pH 6,5, eluiert.

PEDNF was by chromatography medium with a linear salt gradient from about 0. PEDNF eluierte bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,25 M. Der eluierte PEDNF wurde durch Gefriertrocknung konzentriert und in 10 mM Phosphat, pH 6,5, wieder gelöst. PEDNF eluted at a NaCl concentration of about Vessel Due F mit trophischen Geschwüren. The eluted PEDNF Vessel Due F mit trophischen Geschwüren concentrated by lyophilization, and dissolved in 10 mM phosphate, pH 6.

Der eluierte PEDNF wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Gelelektrophorese unterzogen. The eluted PEDNF was prepared as described in Example 3 which is subjected to SDS gel electrophoresis. Beispiel 7 Example 7 Reinigung von PEDNF durch Kationenaustauschchromatographie-HPLC Cleaning of PEDNF by cation exchange HPLC [] [] Mit Ammoniumsulfat ausgefälltes RPE-CM, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen.

With ammonium sulfate-precipitated RPE-CM, prepared as described in Example 5, was dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.

A sample of 80 ul of the dialyzed purified by ammonium sulfate PEDNF protein fraction was applied Vessel Due F mit trophischen Geschwüren a Brownlee Aquapore CX HPLC chromatography, which was packed in a 4. Das Chromatographiemedium wurde zuvor mit 10 Symptome Krampfadern in dem Phosphat, pH 7,2, äquilibriert. The chromatography medium was previously equilibrated with 10 mM phosphate, pH 7.

PEDNF wurde vom Chromatographiemedium mit einem linearen Salzgradienten von 0,0 bis etwa 0,5 M NaCl in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, eluiert. PEDNF was by chromatography medium with a linear salt gradient from 0. PEDNF eluierte als einzelner Peak bei einer NaCl-Konzentration von etwa 0,25 M. The eluted PEDNF was dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.

Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 3 beschrieben, der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. The sample of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was then performed as described in Example 3, subjected. Beispiel 8 Example 8 Reinigung von PEDNF durch Phasenumkehr-HPLC Purification of PEDNF by Reverse-Phase HPLC [] [] Mit Ammoniumsulfat ausgefälltes RPE-CM, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen.

A PEDNF-containing sample of 80 ul was then applied to a Vydac C8 chromatography medium, which was packed into a 4. The chromatography Vessel Due F mit trophischen Geschwüren previously equilibrated with 0. PEDNF was eluted from the chromatography medium with a linear gradient from 0. A PEDNF-containing sample, partially purified as described in Example 2, was then applied to a Vydac C8 chromatography medium, which was packed into a 4.

A PEDNF-containing sample, partially purified as described in Example 6, was then applied to a Vydac C8 chromatography medium, which was packed into a 4. A PEDNF-containing sample, prepared as described in Example 6, was applied to a Brownlee RP chromatography medium, which was packed in a mm column 4.

Partially purified PEDNF prepared as described in Example 5 or 6 was further purified by chromatography on a Bio-Rad TSK chromatography, which was packed into a 7. PEDNF wurde mit 20 mM Tris, pH 7,0, 0,6 M NaCl eluiert. PEDNF was eluted with 20 mM Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, pH 7.

Beispiel 13 Example 13 Anionenaustauschchromatographie Anion exchange chromatography [] [] DEAE-Cellulose wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert.

DEAE-cellulose is treated with 10 mM Tris, pH 7. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. PEDNF, prepared as described in Example 5, is applied to the column and the column is washed with 10 mM Tris, pH 7.

Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa 1 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, eluiert. After all the unbound proteins are eluted, PEDNF is eluted with a linear gradient from 0 to about 1 M NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7.

Diese Fraktionen werden dann gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, diafiltriert, um NaCl zu entfernen. These fractions are then dialyzed against 10 mM Tris-HCl, pH 7. Beispiel 14 Example 14 Anionenaustauschchromatographie Anion exchange chromatography [] [] DEAE-Cellulose wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, äquilibriert. Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit 10 mM Tris, pH 7,5, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind.

PEDNF, prepared as described in Example 2 is applied to the column and the column is washed with 10 mM Tris, pH 7. Beispiel 15 Example 15 Kationenaustauschchromatographie Cation exchange [] [] Bio-Rex 70 Resin-Cellulose Bio-Rad wird mit 10 mM PBS, pH 7,2, äquilibriert.

Bio-Rex 70 resin cellulose Bio-Rad with 10 mM PBS, pH 7. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wurde mit 10 mM PBS, pH 7,2, gewaschen, bis alle ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind. PEDNF, prepared as described in Example 2 is applied to the column and the column was washed with 10 mM PBS, pH 7.

Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wird PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa 1 M NaCl in 10 mM PBS, pH 7,2, eluiert. After all the unbound proteins are eluted, PEDNF is eluted with a linear gradient of 0 to about 1 M NaCl in 10 mM PBS, pH 7.

Beispiel 16 Example 16 Kationenaustauschchromatographie Cation exchange [] [] Bio-Rex 70 Resin-Cellulose Bio-Rad wird mit 10 mM PBS, pH 7,2, äquilibriert. PEDNF, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit 10 mM PBS, pH 7,2, gewaschen, bis Vessel Due F mit trophischen Geschwüren ungebundenen Proteine von der Säule eluiert sind.

PEDNF, prepared as described in Example 5, is applied to the column and the column is washed with 10 mM PBS, pH 7. Nachdem alle ungebundenen Proteine eluiert sind, wurde PEDNF mit einem linearen Gradienten von 0 bis etwa Vessel Due F mit trophischen Geschwüren M NaCl in 10 mM PBS, pH 7,2, eluiert. Das Volumen nach der Dialyse Vessel Due F mit trophischen Geschwüren 19 ml.

The volume after dialysis was 19 ml. The dialysate was at a flow rate of 0. Nachdem die PEDNF-Lösung auf die Heparin-Agarose aufgetragen war, wurde die Heparin-Agarose mit 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, um die ungebundenen Proteine von der Heparin-Agarose zu entfernen. After the PEDNF solution had been applied to the heparin agarose, the heparin agarose Vessel Due F mit trophischen Geschwüren 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7. PEDNF wurde dann von der Heparin-Agarose mit 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M NaCl eluiert.

PEDNF was then eluted from the heparin Vessel Due F mit trophischen Geschwüren with 12 ml 10 mM Tris-HCl, click 7.

The eluate containing PEDNF was dialyzed against 10 mM Tris-HCl, pH 7. The dialyzed eluate was freeze-dried, dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.

Das Volumen des Dialysats betrug 1,3 ml. The volume of the dialysate was 1. Die Heparin-Agarose wurde dann nacheinander eluiert mit: 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl; The heparin agarose was then successively eluted with 12 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7.

Each of the eluates was dialyzed against 10 mM Tris-HCl, pH 7. The dialyzed eluates were then lyophilized in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.

Beispiel 19 Example 19 Neuronale Induktivität und Differenzierungsaktivität des isolierten PEDNF Neural inductance and differentiation activity of the isolated PEDNF [] [] Elektroeluierter PEDNF wurde wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt.

Elektroeluierter PEDNF was prepared as described in Example 3. Um die neuronale induktive Aktivität des isolierten PEDNF zu charakterisieren, wurden die optimale Konzentration und Stimulierungszeitspanne vor der Zelleinsaat bestimmt. To characterize the neuronal inductive activity of the isolated PEDNF, the optimal concentration this web page stimulation were determined before the time period Zelleinsaat.

The Y79 RB cells were grown as a suspension culture. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für Übungsbehandlung für Krampfadern 5 Min. The cells were harvested by centrifugation for about 5 min. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in einer Konzentration von 10 6 ml in serumfreiem DME-Medium resuspendiert.

The cells were collected by centrifugation and resuspended at a concentration of 10 6 ml in serum-free DME medium. Die Zellen wurden täglich durch Phasenkontrastmikroskopie überprüft. The cells were checked daily by phase contrast microscopy. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. The results are shown in Table II. Tabelle II Table II [] [] Eine Stimulationszeit vor der Einsaat in Suspensionskultur von 8 Tagen in Gegenwart dieses Faktors führt zu maximaler Differenzierung von YZellen am Tag 10 nach der Anheftung.

A stimulation time before sowing in suspension culture of 8 days Vessel Due F mit trophischen Geschwüren the presence of this factor results in maximum differentiation of Y79 cells at day 10 after attachment.

Diese Antwort ist jedoch relativ langsam, dh weniger als 15 Tage. This response is relatively slow, ie less than 15 days. PEDNF provoked a high go here of neuronal differentiation in human retinoblastoma cells. Das Auswachsen langer, verästelter neuritischer Fortsätze aus den Aggregaten der stimulierten Zellen wurde angeregt; The outgrowth of long neuritic extensions ramified from the aggregates of the stimulated cells was stimulated; eine damit einhergehende Erhöhung der Expression der neuronalen Markermoleküle, Neuron-spezifische Enolase und des An der Expression des neuronalen Phänotyps in YZellen scheinen drei aufeinander folgende Ereignisse beteiligt zu sein: 1 Stimulation der Zellen in Suspensionskultur durch PEDNF; On the expression of the neuronal phenotype in Y79 cells three consecutive events appear to be involved: 1 stimulation of cells in suspension culture by PEDNF; 2 Anheftung der stimulierten Zellen an ein Substrat; 2 attachment of just click for source cells to a substrate; gefolgt von 3 Auswachsen von Neuriten aus den angehefteten, stimulierten Zellen.

Beispiel 20 Example 20 Vergleich der Wirkung von RPE-CM von verschiedenen Arten Comparison Vessel Due F mit trophischen Geschwüren the effect of RPE-CM from various species [] [] Zellkulturen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben angelegt, jedoch stammten die Augen aus check this out die Zellen gewonnen wurden entweder von menschlichen Föten, erwachsenen Menschen, fötalen Ratten, erwachsenen Ratten oder embryonalen Hühnern.

Cell cultures were applied as described in Example 1, except the eyes from which came the cells were recovered from either human fetal, adult human, fetal rats, or embryonic chickens adult rats. RPE-CM was prepared from all cell cultures as described in Example 2. Fötale menschliche Zellkulturen, die frisch angelegt wurden Kurzzeitkulturen und Kulturen, die für 6 Monate angelegt wurden Langzeitkulturen wurden mit eingeschlossen.

Fetal human cell cultures that were freshly applied short-term cultures and cultures that have been created for 6 months long-term cultures were included. The differentiation activity of the conditioned media was determined as described in Example The results of experiments to measure the effects of RPE-CM from various species are summarized in Table III. The table below summarizes the inductive activity of different RPE-conditioned media on Y79 cells together.

Conditioned media from human fetal and embryonic chicken RPE contains a similar neurotrophic activity, while those are less effective in promoting the neuronal phenotype in Y79 cells from adult cultures chicken and rat and long-term cultures of human fetal RPE-CM.

Es ist möglich, dass reife RPE-Zellen den neurotrophen Faktor nicht mehr absondern, oder dass sie verringerte Mengen absondern, die bei den verwendeten Kulturbedingungen weniger wirksam sind. It is possible that mature RPE cells no longer secrete neurotrophic factor, or that they secrete reduced amounts that are less effective in the culture conditions used. Die Tatsache, dass eine gewisse neurotrophe Aktivität in RPE-konditionierten Medien von anderen Arten gefunden wird, legt nahe, dass PEDNF oder ein ähnlicher Faktor auch durch RPE-Zellen von anderen Arten abgesondert wird und grundsätzlich wichtig für die normale Entwicklung und Funktion der Netzhaut sein kann.

The fact that a certain degree of neurotrophic activity is found in RPE-conditioned media from other species suggests that PEDNF, or a similar factor is also secreted by RPE cells of other species and in principle be important for the normal development and function of the retina can.

Beispiel 21 Example 21 Zweidimensionale Gelelektrophorese Two-dimensional gel electrophoresis [] [] Eine zweidimensionale Gelanalyse wurde nach der von O'Farrell, J.

A two-dimensional gel analysis was carried out according to that of O'Farrell, J. Silver staining was performed using the Bio-Rad "Silver Stain Plus Kit". Die vier Arten variieren leicht in ihrem relativen Molekulargewicht, aber alle befinden sich in der Molekulargewichtsregion The four types vary slightly in their relative molecular weight, but Vessel Due F mit trophischen Geschwüren are in the region of 50, molecular weight of Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gel, which is consistent with Vessel Due F mit trophischen Geschwüren previously determined molecular weight of PEDNF.

Die aufgelösten Arten variieren auch geringfügig in ihrem isoelektrischen Punkt, was auf leichte Variationen bei der posttranslationalen Modifikation hindeutet. The resolved species also vary slightly in their isoelectric point, suggesting slight variations in post-translational modification. Die Aminosäuresequenzanalyse siehe Beispiel 22 wies jedoch auf die Anwesenheit eines einzigen Polypeptids hin.

The amino acid sequence analysis see Example 22however, pointed out the presence of Vessel Due F mit trophischen Geschwüren single polypeptide. To the protein sample endoproteinase Lys-C was added. The resulting PEDNF polypeptide fragments were separated by HPLC on a Vydac C8 reverse-phase HPLC packed into a 4.

The column was equilibrated with 0. Ob es eine Brennnessel eluted from the column polypeptides which were well separated from other polypeptides were collected and subjected to protein sequence analysis.

Die Aminosäuresequenzanalyse wurde im Auftrag bei der Mikrosequenzierungseinrichtung des Beckman Forschungsinstituts am City of Hope durchgeführt. The amino acid sequence analysis was performed in order to the micro-sequencing facility of the Beckman Research Institute at City of Hope. The sequencing of PEDNF yielded 19 residues with a unique sequence.

PEDNF ergab 26 Reste von denen 25 eindeutig waren. PEDNF yielded 26 residues of which 25 were unique. Die Identifizierung von Rest 23 in PEDNF als Tryptophan war nicht absolut sicher. The identification of residue 23 in PEDNF as tryptophan was not absolutely sure.

Beispiel 23 Example 23 Isolierung von PEDNF-spezifischen Peptiden und Aminosäuresequenz Isolation of PEDNF-specific peptides and amino acid sequence [] [] PEDNF, gereinigt wie in den Beispielen 2, 6 und 12 beschrieben, wurde reduziert und alkyliert. PEDNF, purified as described in Examples 2, 6 and 12 described, was reduced and alkylated. The sample was dried in 50 ul CRA buffer 8 M urea, 0.

The solution Sigma Chemical Co. Nach 15 Minuten wurde die Lösung auf eine Konzentration von 2 M Harnstoff verdünnt und einer Trypsinspaltung unterworfen erhältlich bei Boehringer-Mannheimunter Click here eines Enzym : Substrat-Verhältnisses von 1 : 25 Gew. After 15 minutes the solution was diluted to a concentration of 2 M urea, and a trypsin cleavage chromatography available from Boehringer-Mannheimusing an enzyme: substrate ratio of 1: wt.

Tryptic peptides were Engbohrung by a reverse-phase HPLC on a Hewlett-Packard HPLC equipped with a diode array detector and using a Vydac 2. Buffer A was 0. Chromatographische Daten beinm und UV Spektren von bis nm wurden von jedem Peak erhalten. Chromatographic data atnm and UV spectra from to nm were obtained from each peak.

Proben für die aminoterminale Sequenzanalyse wurden auf einen vorzyklisierten Polybren-Glasfaserfilter aufgetragen und dem automatisierten Edman-Abbau bei der Harvard-Microchemical- Einrichtung in Boston, MA, auf einem ABI Modell A Gasphasen-Proteinsequenzierer unter Verwendung des Programms NORMAL 1 unterworfen. Samples for amino terminal sequence analysis were applied to a polybrene-vorzyklisierten glass fiber filter and subjected to automated Edman degradation at the Harvard Microchemical- device in Boston, MA, on an ABI model A gas-phase protein sequencer using program NORMAL 1.

Die erhaltenen Phenylthiohydantoin-Aminosäurefraktionen wurden unter Verwendung einer angeschlossenen ABI Modell A-HPLC und einem Shimadzu CR4A-Integrator manuell identifiziert. The obtained phenylthiohydantoin amino acid fractions were manually identified using an ABI Model A HPLC connected and a Shimadzu CR 4a integrator.

PEDNF shows significant sequence. Homologe Moleküle umfassen Ratten-Serinproteaseinhibitor 1 und 2, ein Ratten-Hepatocyten Wachstumshormon-reguliertes Protein, ein Ratten-Thyroidhormon-reguliertes Protein und Maus-Contrapsin.

Homologous molecules include rat serine protease inhibitor-1 and 2, a rat hepatocyte growth hormone-regulated protein, a rat thyroid hormone-regulated protein, and mouse Contrapsin. Menschliches, Affen- Schaf- Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Maus-AlphaAntitrypsin und Schweine-AlphaAntichymotrypsin, zeigen signifikante wenn auch etwas schwächere Homologie.

Human, monkey, sheep and mouse alphaantitrypsin and porcine alphaantichymotrypsin, show significant although somewhat weaker homology. PEDNF zeigt Homologien mit Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Proteaseinhibitoren, aber der Grad der Homologie ist geringer als der für PEDNF beobachtete.

PEDNF shows homologies with various protease inhibitors, but Vessel Due F mit trophischen Geschwüren degree of homology is lower than that observed for PEDNF Diese beinhalten menschlichen Plasmaprotease-C1-Inhibitor und menschlichen alphaAntiplasmininhibitor.

These include human plasma protease C1 inhibitor and human alpha-2 Antiplasmininhibitor. Diese Ergebnisse legen Vessel Due F mit trophischen Geschwüren, dass PEDNF eine Funktion als Proteaseinhibitor haben könnte, aber dass er molekular verschieden von solchen vorher beschriebenen Inhibitoren ist.

These results suggest that PEDNF may have a function Vessel Due F mit trophischen Geschwüren a protease inhibitor, but that it is molecularly distinct from such inhibitors previously described. Es ist von Interesse, dass gezeigt werden konnte, dass eine Anzahl bekannter Mitglieder der Serpin-Familie neurotrophe Wirkung auf eine Vielfalt neuronaler Zelltypen ausübt. Zum Beispiel fördert gliäres Nexin GDN Neuritenwachstum bei Neuroblastomazellen, so wie dies eine Anzahl anderer Proteaseinhibitoren wie Hirudin und Leupeptin tun.

Proteaseinhibitoren stimulieren auch die neuronale Differenzierung in Zellen der Dorsalwurzelganglien, sympathischen Neuronen und Vessel Due F mit trophischen Geschwüren http://varizen247.de/creme-aus-varizen-2.php Hippocampus. Es ist auch von Interesse, dass die Herstellung von Proteasen und Proteaseinhibitoren durch eine Anzahl bekannter Faktoren stimuliert wird.

Während noch nachgewiesen werden muss, ob PEDNF Proteaseinhibitor-Aktivität besitzt, ist dies jedoch wahrscheinlich, da gezeigt werden konnte, dass eine inhibitorische Aktivität notwendig für die Neuriten-fördernde Aktivität von gliärem Nexin ist. PEDNF shows significant homology with serpins, the family of serine protease inhibitors, which have a reactive center near the C-terminal end together, which serves as the exposed binding site that act as "bait" for serine proteinase targets.

It is of interest that shown could be that a number of known members of the serpin family exerts neurotrophic effects on a variety of neuronal Krampfadern erkennen types. For example, promotes gliäres nexin GDN neurite outgrowth in neuroblastoma cells, as do this, a number Krampfadern Blutgerinnsel der Schwangerschaft other protease inhibitors such as hirudin and leupeptin.

Protease inhibitors also stimulate the neuronal differentiation in cells of the dorsal root ganglia, sympathetic neurons and pyramidal neurons of the hippocampus. It is also of interest that the production of proteases and protease inhibitors by a number of known factors is stimulated. While yet to be proven whether PEDNF has protease inhibitor activity, this is However, probably because it has been shown that inhibitory activity is necessary for the neurite-promoting activity of gliärem nexin.

Es ist gut möglich, dass PEDNF ähnlich funktioniert, da bekannte Proteasen in der Interphotorezeptormatrix und in der sich entwickelnden neuralen Netzhaut vertreten sind. It is continue reading possible that PEDNF works similarly as known proteases are present in the interphotoreceptor matrix and in the developing neural retina. Eine Charon BS cDNA-Genbank aus menschlichem fötalem Auge, zur Verfügung gestellt von Dr.

Swaroop, wurde einmal vermehrt mit einem Verfahren, das in Sambrook Vessel Due F mit trophischen Geschwüren al. A Charon BS cDNA library from human fetal eye, provided by Dr. Swaroop, was once more with a process. Innis, Gelfand, Sninsky und White, Hrsg. This probe was used to scanPfu plaque forming units of the Vessel Due F mit trophischen Geschwüren gene bank Positive Klone wurden isoliert wie bei Sambrook et al. Positive clones were isolated as described in Sambrook et al.

The inserts were excised with NotI BRL, Gaithersburg, MDwith T4 Vessel Due F mit trophischen Geschwüren ligase New England Vessel Due F mit trophischen Geschwüren closed to the ring, transformed into competent E.

White colonies were selected and a mini-preparation Qiagen plasmid mini-prep protocol subjected. One of the identified clones which contained Vessel Due F mit trophischen Geschwüren insert corresponding to the PEDNF gene was selected for mapping and subsequent sequencing using a USB Sequenase 2. Beispiel 27 Example 27 Behandlung von Tumoren der Netzhaut Treatment of tumors of the retina [] [] PEDNF wird allein oder in Verbindung mit klinischen wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren verabreicht.

PEDNF is administered, alone or in conjunction with clinical such as surgical procedures. Treatment with PEDNF is effective in tumors of the retina as retinoblastoma, in other neural tumors such as neuroblastoma tumors or non-neuronal origin.

Beispiel 28 Example 28 Neurotrophe Behandlung von Augenerkrankungen Neurotrophic treatment of ophthalmic diseases [] [] PEDNF wird allein oder in Verbindung mit klinischen wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren verabreicht. Beispiel 29 Example 29 Neurotrophe Behandlung von verletzten Nerven Neurotrophic treatment of injured nerves [] [] PEDNF wird allein oder in Verbindung mit anderen klinischen wie zum Beispiel chirurgischen Verfahren verabreicht.

PEDNF wird durch intravitreale oder subretinale Injektion oder aber durch Anwendung oder Injektion an den Orten Varizen der linken Hoden Nervenverletzung verabreicht. PEDNF is administered by intravitreal or subretinal injection or by application or injection at the sites of nerve injury.

Beispiel 30 Example 30 Transfektion von Bakterienzellen Transfection of bacterial cells [] [] Kompetente E. Das Gemisch wird dann für 2 Min. The mixture is then left for 2 min. The recombinant colonies are screened using mini preparation and cleavage of the isolated DNA. Nach der Bebrütung über Nacht werden die Kulturen in Zentrifugenbecher überführt und bei 2. Trophischen Geschwüren Krampfadern Behandlung Gemisch wird dann für etwa 45 Sek.

Die Lösung wird dann in einem Eiswasserbad für 2 Min. Positive colonies containing appropriate insertions are then prepared by adding After incubation overnight, the transferred cultures in centrifuge cup and centrifuged at 2, rpm for 10 min. The supernatant is removed and the cells are cultured in 30 ml STET buffer 0.

Vessel Due F mit trophischen Geschwüren bottle is then gently mixed directly over a flame until the cells begin to clump together and to be white. The mixture is then for about 45 sec. The solution is then cooled in an ice-water bath for 2 min.

The supernatant is then transferred to a clean container. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation bei 2. Vessel Due F mit trophischen Geschwüren precipitate was collected by centrifugation at 2, g for 15 min. CAP is then inactivated by adjusting the solution with EDTA to 25 mM and SDS to 0. The aqueous phase was collected and Der Niederschlag wird dann durch Zentrifugation bei Article source precipitate is then collected by centrifugation at 12, rpm for 10 min.

The ethanol is then removed, and the DNA in Beispiel 33 Example 33 Ligierung von PEDNF in pAC Ligation of PEDNF in pAC [] [] Ein gereinigtes DNA-Fragment, welches das PEDNF-Gen umfasst, wird mit dem Transfervektor ligiert. A purified DNA-fragment comprising the PEDNF gene is ligated to the transfer vector. Etwa ng des gespaltenen pAC werden bei Sport mit Krampfadern einem einer gleichen molaren Konzentration eines PEDNF enthaltenden Fragments gemischt.

Approximately ng of the digested pAC be mixed with an equal molar concentration of a PEDNF containing fragment. Ligation buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7. Water is added to a total volume of 10 ul. Das Gemisch wird für 3 Std. The mixture is left for 3 hrs. Sf9 cells are seeded 2 bottles with a density of 2.

Den Zellen lässt man für mindestens 1 Std. Zeit, um sich anzuheften. The cells allowed for at least 1 hr. Time to attach themselves. The medium is removed from the flask and replaced with 0. Die DNA-Lösung wird zum Graces Medium gegeben, das sich bereits in den Kulturflaschen befindet.

The DNA solution was added to the Graces medium that is already in the culture flasks. Calcium phosphate precipitates form due to the calcium chloride in transfection and phosphate in the medium. Die Flaschen werden für Vessel Due F mit trophischen Geschwüren Std. The bottles are left for 4 hrs. Die Zellen werden Tage bebrütet. The cells were Vessel Due F mit trophischen Geschwüren for read article. Sobald die Infektion in einem fortgeschrittenem Stadium ist, wird der Virus auf frische einzellige Schichten ausgebracht und die rekombinanten Viren werden Krampfadern Hautausschlag den Plaques gereinigt.

Once the infection is Krampfadern primäre an advanced stage, the virus is spread on fresh monolayers, and the recombinant viruses are purified from the plaques.

Beispiel 35 Example 35 Identifizierung von rekombinanten Proteinen Identification of recombinant proteins [] [] Aus Plaques gereinigte Viren werden mittels radioaktiver Markierung abgesucht. Purified from plaques viruses are screened using radioactive labeling. Die rekombinanten Proteine werden auf SDS-PAGE-Gelen identifiziert. The recombinant proteins are identified on SDS-PAGE gels.

Die Zellen lässt man für 1 Std. The cells allowed for 1 hr. Das Medium wird dann entfernt und die Zellen werden mit Medium überschichtet, das den Virus enthält und für 1 Std. The medium is then removed and the cells are overlaid with medium containing the virus and incubated for 1 hr. Die Zellen werden für 48 Std.

The cells were incubated for 48 hr. Am Ende dieser Bebrütungszeit wird das Medium entfernt. At the end of this incubation the medium is removed. The supernatant is collected and the cells are suspended in An equal volume of mM Tris, pH 6. Die Proben werden dann für 3 Min. The samples are then boiled for 3 min. Kontrollen mit nicht-infizierten Zellen und Zellen, die mit Wildtyp-Virus infiziert wurden werden mit eingeschlossen.

Controls with uninfected cells and cells infected with wild-type virus are included. The above descriptions of exemplary embodiments of the neurotrophic factor of pigmented Netzhautepithel are illustrative. Aufgrund von Abwandlungen, die dem Fachmann zum MRT mit Krampfadern die werden, ist es nicht beabsichtigt, dass sich die vorliegende Erfindung auf die jeweiligen, oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt.

Because of variations which will occur to those skilled obviously, it is not intended that the present invention be limited to the respective embodiments described above. Der Geltungsbereich der Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert.

The scope of the invention is defined by the following claims.


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